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一套能真正支撑IND申报的RSV临床前药效评价体系应该长什么样？

在RSV（呼吸道合胞病毒）候选药物临床前评价阶段，药效数据包是整个IND申报的核心支撑。然而，很多项目团队的数据包存在两个共同缺陷：其一，体外仅测了EC₅₀，缺乏对单抗、多肽和ADC各自特异性体外评价指标的覆盖；其二，体内评价局限于单一动物模型，缺乏多模型联用的系统性设计。

RSV药物管线早已是多模态并驾的时代——nirsevimab（单抗）横扫婴幼儿RSV预防市场，构象约束多肽凭借高耐药屏障填补小分子不足，RSV-ADC正为移植受者高危人群探索全新治疗窗口。

本文将完整的临床前评价体系拆解为两大部分：体外检测和体内评价，并针对四种模态各自的评价逻辑差异进行系统梳理，以供参考。

**部分：体外检测

01

体外检测方法总览：四模态差异化选择

体外评价是临床前数据包的起点。不同模态的"活性"定义差异显著——小分子和多肽评价直接抑制病毒复制的能力（EC₅₀），单抗评价中和病毒感染的能力（PRNT₅₀），ADC评价对感染细胞的选择性杀伤能力。

昌柏科技：T/CAV团标参比实验室

02

病毒株覆盖：四种模态的共同底线

无论哪种模态，体外评价的科学价值很大程度上取决于测试病毒株的代表性。CDE和FDA均要求体外活性数据覆盖临床代表性RSV毒株——这是所有模态的共同基础要求。

03

小分子：EC₅₀/CC₅₀/SI、

时序实验与耐药屏障

3.1 

EC₅₀/CC₅₀与选择性指数（SI）

EC₅₀（半数有效浓度）是小分子体外活性评价的起点，但误把EC₅₀当作**根据是研发中最常见的陷阱。完整的安全窗评价须同步计算CC₅₀（半数细胞毒性浓度）和选择性指数（SI = CC₅₀/EC₅₀）。

昌柏科技搭建了包含标准株与临床株在内的 RSV 多亚型、多毒株 EC₅₀药效评价体系，下图展示 Ziresovir 在多株经典 RSV 模式毒株上的剂量 - 抑制拟合结果。

昌柏科技搭建了包含标准株与临床株在内的 RSV 多亚型、多毒株 EC₅₀药效评价体系，下图展示 Ziresovir 在多株经典 RSV 模式毒株上的剂量 - 抑制拟合结果。

3.2


时间-病毒曲线（ToA）：作用机制的核心证据

时间-病毒曲线（Time-of-Addition Assay，ToA）是小分子体外药效评价中信息量最丰富的实验，可同时提供作用阶段确认、抗病毒动力学特征、候选物靶点初步归属和与对照药物的差异化比较。

3.3 

抗病毒后效（PAVE）与PK/PD指数

04

单克隆抗体：PRNT中和活性与Fc效应功能评价

4.1 

抗原设计：pre-F vs. post-F的关键抉择

• pre-F稳定化抗原（DS-Cav1、SC-TM构象）暴露Site I/II/IV等高度保守的强中和表位，是单抗筛选的**抗原。nirsevimab靶向pre-F Site II/IV，以此为参照。

• 以post-F筛选的抗体整体中和活性普遍偏弱，通常仅用于表位谱研究而非筛选主力。

• 双亚型覆盖验证：RSV-A/B F蛋白Site II同源性高于99%，以pre-F筛选的优质候选抗体通常可双亚型覆盖，但须在RSV-A2和RSV-B参考株上分别测定PRNT₅₀，活性比值不超过5倍。

4.2 

中和活性与功能评价核心方法

昌柏科技依托 T/CAV 团体标准 PRNT 中和试验平台搭建 RSV 多亚型中和活性评价体系，下图展示 Nirsevimab、Clesrovimab 两款长效单抗对 RSV 标准参考株及国内 BA9/ON1 临床流行突变株的剂量 - 中和拟合曲线。

05

多肽：筛选策略、构象约束与稳定性评价

RSV多肽抑制剂的主战场是F蛋白融合过程——外源HR2多肽竞争性阻断HR1-HR2螺旋-螺旋相互作用，高度保守的HR1靶点赋予多肽天然的高耐药屏障。体外评价须同步覆盖活性、稳定性和黏膜渗透三个维度。

多肽特有额外体外评价终点：

• 血浆稳定性（Plasma Stability）：人/大鼠血浆，37°C，0–24 h LC-MS/MS追踪，构象约束多肽目标t1/2高于4 h；线性多肽须稳定性验证合格后方可进入棉鼠体内实验。

• 黏液穿透率（Mucus Permeability）：人工黏液（1% mucin，pH 7.0）模型中有效渗透系数Papp，目标高于1×10⁻⁶ cm/s。

• 热稳定性（DSF）：检测多肽-F蛋白复合体Tm，验证与HR1螺旋束结合构象正确性，目标ΔTm超过3°C。

06

ADC：靶向-载荷-连接子三元活性评价

RSV-ADC的核心逻辑：以RSV感染细胞高表达的F蛋白胞外域为靶标（感染后12–48 h峰值表达），中和抗体作为载体将有效载荷定向递送至感染细胞，实现局部高浓度抗病毒效应，同时规避全身毒性。

ADC体外评价关键实验：

• 内化效率（Internalization Assay）：pHrodo/Cy5标记ADC，与RSV感染A549（感染后4 h）共培养，流式/共聚焦检测胞内荧光；目标24 h内化率高于50%。

• 细胞选择性（SI）：ADC与感染细胞（感染后4 h）和未感染细胞并行处理72 h，CellTiter-Glo读数；SI = IC₅₀（未感染）÷ IC₅₀（感染细胞），目标SI高于10。

• 旁观者杀伤效应（Bystander Killing）：流式分析RSV N蛋白阴性（未感染）细胞活力，未感染细胞存活率高于80%为优选。

• 血浆连接子稳定性：37°C人血浆孵育0/24/48/72 h，LC-MS/MS或HIC-HPLC检测DAR变化；72 h游离payload释放率低于5%为合格线。

第二部分：体内评价

从棉鼠鼻肺模型到NHP——把体外数据转化为临床依据

07

棉鼠（Sigmodon hispidus）鼻肺

感染模型：四种模态的核心平台

棉鼠是目前**能支持RSV高效复制并产生可量化感染表型的小动物模型，是FDA非临床指导原则和EMA科学建议中一致推荐的RSV体内药效评价**模型。昌柏科技已建立标准化棉鼠RSV感染模型（A型和B型均可），建模成功率高于95%，攻毒保护终点涵盖肺部病毒载量检测（qPCR + TCID₅₀）、鼻甲病毒载量检测、病理检测及体重曲线。

7.1 

建模标准与接种方案

▲ 昌柏科技：实验用棉鼠（SPF级）

7.2 

给药方案：按模态差异化设计

7.3

 棉鼠模型病理检测：RSV-A和RSV-B亚型均可建模

08

BALB/c小鼠RSV感染模型：免疫机制评价与吸入制剂支持

免疫功能正常的BALB/c小鼠可用于评估RSV诱发的气道炎症反应和免疫病理，也可配合免疫抑制方案用于抗病毒药效评价，并支持吸入制剂（多肽、小分子）的体内药效评估。昌柏科技已建立BALB/c小鼠RSV感染保护性模型，支持雾化吸入给药方案。

▲ 昌柏科技：实验用BALB/c小鼠（SPF级）

多肽特有额外体外评价终点：

• 血浆稳定性（Plasma Stability）：人/大鼠血浆，37°C，0–24 h LC-MS/MS追踪，构象约束多肽目标t1/2高于4 h；线性多肽须稳定性验证合格后方可进入棉鼠体内实验。

• 黏液穿透率（Mucus Permeability）：人工黏液（1% mucin，pH 7.0）模型中有效渗透系数Papp，目标高于1×10⁻⁶ cm/s。

• 热稳定性（DSF）：检测多肽-F蛋白复合体Tm，验证与HR1螺旋束结合构象正确性，目标ΔTm超过3°C。

▲ 昌柏科技实测：BALB/c小鼠雾化吸入给药体内药效（qPCR + TCID₅₀双终点）

9

非人灵长类（NHP）RSV感染模型：

单抗与ADC的高级验证平台

非人灵长类（African Green Monkey或恒河猴）RSV感染模型是评价单克隆抗体、ADC及小分子融合抑制剂的高级动物模型，其气道解剖和免疫应答与人类最为接近。FDA通常要求单抗类候选物在IND申报前提供NHP药效数据。

10

PRNT数据在体内评价中的应用：

两类候选物的免疫学证据

PRNT法在体内药效评价阶段的核心价值在于将动物体内路径（静脉注射、皮下注射）产生的免疫反应转化为可量化的功能性中和活性数据，为单抗和小分子/多肽/ADC候选物推进提供免疫学根据。

11

气道类器官（ALI）过渡模型：

体外体内的桥接平台

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基于原代人支气管上皮细胞构建的气道类器官（Airway Organoid）或气液界面（ALI）培养系统，兼具体内生理相关性和体外可控性，是弥合细胞系模型与动物模型之间转化鸿沟的重要过渡平台。

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适合早期候选物筛选和作用机制研究，不直接替代FDA监管认可的棉鼠或NHP模型，但可作为IND数据包的重要补充支持——尤其对于吸入给药候选物（多肽、小分子吸入制剂），ALI模型的黏膜渗透数据具有独特价值。



12

六类模型综合比较与选择逻辑

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13

昌柏科技RSV四模态

临床前评价全链条能力

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[体外病毒学(全模态)】：ECs/CCso/SI(CCK-8法/空斑法);TCIDs0;gRT-PCR;30+株临床流行株(A.D.3/A.D.5.2/B.D.E.1/B.D.4.1.1);中美双申报毒株谱系全覆盖。

【PRNT中和抗体评价(单抗)】：T/CAV团标参比实验室；PRNT50/PRNT90；Karber法+4参数拟合双算法；覆盖A2/Long/B18537/B9320参考株及BA9/ON1临床株。

【棉鼠鼻肺模型(全模态)】：RSV-A/B棉鼠感染模型(>95%建模成功率);肺PFU+TCIDso+gRT-PCR三重终点;鼻甲病毒载量;H&E病理评分。

【BALB/c模型(抗病毒+吸入制剂)】：免疫正常/免疫抑制双组设计;支持雾化吸入给药方案(多肽、小分子吸入制剂);肺病毒载量+病理+体重曲线。

参考文献

[1]  FDA Guidance for Industry: Antiviral Product Development—Conducting and Submitting Virology Studies to the Agency. 2006.

[2]  EMA Guideline on the clinical evaluation of medicinal products indicated for the prophylaxis or treatment of RSV disease. EMA/CHMP/257022/2017.

[3]  CDE《抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则》（2012年）；《抗病毒药物临床研究技术指导原则》（2022年修订版）.

[4]  Hammitt LL, et al. Nirsevimab for Prevention of RSV in Healthy Late-Preterm and Term Infants (MELODY). N Engl J Med. 2022;386(9):837-846.

[5]  Prince GA, et al. The cotton rat model of RSV infection. Expert Review of Anti-infective Therapy. 2009;7(4):389-398.

[6]  Perron M, et al. GS-5806 inhibits multiple steps of the RSV fusion process. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2016;60(11):6781-6791.

[7]  Bhatt P, et al. Peptide-based RSV fusion inhibitors: recent advances and future prospects. Antiviral Res. 2023;210:105513.

[8]  Jorquera PA, et al. Understanding RSV disease and the road toward better therapeutics. Viruses. 2021;13(11):2179.



本文系昌柏科技「RSV管线全周期实战指南」系列第三期，所有监管信息以WHO、FDA及NMPA/CDE官方现行有效文件为准，建议读者在具体项目决策前查阅原始文件最新版本。

关于昌柏科技



安吉昌柏科技有限公司，聚焦于菌毒应用，尤其是传染病领域，形成了传染病药物与疫苗筛选评价、兽用药物疫苗开发评价、菌毒种放行检测等多个业务模块。目前可提供100余种传染病药物与疫苗相关评价管线，覆盖90%的主流研发管线。现有菌毒种资源广泛，覆盖病毒、细菌、真菌、支原体，且主要为国内三年内流行菌毒株。所有临床菌毒株来源清晰、合规、可溯源。可使用A/BSL-3级生物安全实验室，备案14种高致病性病原。A/BSL-2实验室1000平米以上，备案47种病原，负压笼位3000余笼。昌柏科技凭借优质的服务，**的专家团队储备，为国内外多家传染病药物及疫苗公司长期提供药效学评价与临床生物样本分析服务。