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一套能真正支撑IND申报的流感抗病毒药效评价体系应该长什么样？

临床前阶段，药效数据是整个申报包的地基。它要替你回答两件事：药对流感病毒到底管不管用？以及，用多大剂量、什么时候给，才真正有效？前一个问题交给体外评价，后一个问题，得靠动物模型来答。

可惜的是，不少团队在这两步上都做得偏单薄。体外只测一株病毒的EC₅₀，体内只跑一个PR8小鼠存活率——这样的包递上去，CDE和FDA多半会让你补一大堆数据回来。流感药跟抗菌药不一样的地方就在这儿：病毒变异快，给点药物压力它就选出耐药突变。所以体外得把代表性流行株和已知耐药株都覆盖到，体内则要挑机制和临床最贴近的模型来做。这篇就把一套经得起审评的药效评价体系，从头到尾拆开讲讲。

01

体外药效评价：活性数据的基石

体外药效，远不止测一个EC₅₀那么简单。一套站得住脚的体外评价，要顺着三个层层递进的问题往下走：药有没有活性？对宿主细胞安不安全？它又是怎样、在什么环节把病毒摁住的？三个问题答完，候选物的体外底子才算摸清。

1.1 EC₅₀测定：起点而非终点

EC₅₀（50%有效浓度）是抗流感小分子活性评价的起跑线，可它绝不是终点线。把单一毒株的EC₅₀拿来当作差异化竞争力的**证据，是研发攻坚期最容易踩的坑。道理也不复杂：流感病毒变异性那么高，一株病毒上的漂亮数字，撑不起一份IND。

1.1.1 测定方法与读数选择

昌柏科技采用 MTS / CCK 法读取细胞活力，下图为 96 孔板梯度稀释后的显色实拍：

▲ 昌柏科技实测：MTS 法测定细胞活力，药物经梯度稀释后孔板显色由深至浅，颜色越深提示细胞活力越高、抗病毒保护越强

1.1.2 毒株覆盖的标准要求

EC₅₀这个数字值不值钱，很大程度上看你拿哪些毒株测出来的。CDE和FDA的指导原则在这点上态度一致：体外抗病毒谱必须把当下流行的主要亚型、已知耐药株都囊括进来。要知道，现在临床上分出来的流感株，不少本身就揣着耐药位点。你要是只拿PR8、H3N2 X-31这类实验室老株去测，那等于专挑"听话的病毒"练手，真碰上临床患者身上分离的株，很可能就摁不住了。所以毒株集建议分两层来铺：

毒株覆盖建议

中国本土流行株的特别重要性：CNIC年度监测数据显示，近年来B/Yamagata系已接近消除，H1N1、B/Victoria系和H3N2是主要流行株，但各年度优势亚型动态变化。如果仅使用早年实验室传代株（如PR8），无法反映当前临床实际流行情况，且会在CDE审评中被明确指出。建议重点适应症

毒株至少含"近两年内CNIC监测主流分离株"。

参考：FDA Guidance for Industry: Influenza: Developing Drugs for Treatment and/or Prophylaxis. CDER. April 2011；WHO GISRS年度毒株监测报告

昌柏科技自主建设并维护完整的流感毒株库，覆盖从标准模式株到高致病性禽流感代表株的全谱系：

▲ 昌柏科技流感毒株库（部分）：标准模式株来源清晰（ATCC / NIBSC），并备有 H5N1 多 Clade、H7N9 等高致病性禽流感株，可在 ABSL-3 条件下操作

昌柏科技已建立多亚型、多毒株的 EC₅₀ 测定体系，以下为巴洛沙韦在多株模式株上的实测拟合结果：

▲ 昌柏科技实测：巴洛沙韦对多株 H1N1 / H3N2 / B(Victoria) 模式株的 EC₅₀ 拟合曲线（CCK-8 法）

1.2 细胞毒性（CC₅₀）与选择指数（SI）：

不可跳过的安全性关口

EC₅₀告诉你的，只是药能不能把病毒拦下来。可它对宿主细胞下不下得了狠手，得另问一个数——CC₅₀（50%细胞毒性浓度），再用选择指数（SI = CC₅₀/EC₅₀）一除，安全余量就出来了。抗病毒药和抗菌药的分野，恰恰在这里：病毒躲在宿主细胞里复制，药物想杀它，又不能伤了细胞这个"房东"。这条窄路，每个抗病毒分子都得走。

CC₅₀测定方法：在未感染的MDCK（或MDCK-SIAT1）细胞中，加入系列稀释浓度的候选化合物，孵育与EC₅₀实验相同时长（通常48—72 h），以MTT或中性红法测定细胞活力，计算CC₅₀。建议同步在第二种人源细胞系（如A549肺上皮细胞）中重复测定，以提升数据可信度。

选择指数（SI）判断标准

优质候选物要求 SI = CC₅₀/EC₅₀ ≥ 1000。SI < 100 的候选物通常无法推进临床开发，需回到先导化合物优化环节。

参考：De Clercq E, Li G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clinical Microbiology Reviews. 2016;29(3):695–747.

1.3 病毒抑制动力学评价：最有说服力的

机制工具

要论体外评价里信息量最大的一组实验，病毒抑制动力学当之无愧。它一次能告诉你好几件事：药卡在病毒复制周期的哪一步、是看浓度还是看时间起效、跟现有药比起来摁得有多深。下面三个设计串起来，动力学这块就基本完整了。

设计 01 作用时相分析（Time-of-Addition Assay） 在感染前2 h、感染同时（0 h）、感染后2 h、4 h、6 h等不同时间点分别加入候选化合物，于感染后24 h收集细胞上清测定病毒滴度（TCID₅₀）。各时间点的抑制率连成曲线，药究竟卡在哪一步——吸附、穿入、基因组复制还是出芽释放——就一目了然。这个结果往下能直接指导体内给药时机怎么定，往上也是IND里作用机制（MoA）证据链的关键一环。

设计 02 病毒产量减少动力学（多轮感染/Multi-Cycle Assay） 在MDCK细胞中以MOI（感染复数）= 0.001低剂量感染，加入系列浓度候选化合物，于感染后24 h、48 h、72 h分别收集上清测TCID₅₀，把病毒增殖曲线（Viral Growth Curve）画出来。无药对照和参照药（奥司他韦／玛巴洛沙韦）得同步跑。几条增殖曲线一叠，候选物在多轮感染里到底压得住压不住、压多久，就量化出来了——这比单点EC₅₀那一个数字，离体内的真实战况近得多。

设计 03 参照药物并行测定与差异化定位 这里有个值得花心思的做法：把奥司他韦（NA抑制剂对照）和玛巴洛沙韦（PA内切酶抑制剂对照）拉到完全相同的条件下，跟候选物一起测EC₅₀和抑制动力学。这样"优于／等效／劣于现有药"就不再是一句空话，而是一组拿得出手的定量结论——CDE审评里讲的"差异化定位"，靠的正是这种数据。再说个实操要点：面对NA-H275Y耐药株，奥司他韦的EC₅₀往往要飙高100倍以上；这时候你的候选物如果EC₅₀升幅还能压在4倍以内，那"覆盖耐药株"这张牌就实实在在攥在手里了。

▲ 昌柏科技实测：不同 PA 抑制剂对流感病毒 PA 核酸内切酶活性的抑制（IC₅₀ 对比）

1.4 体外耐药屏障评估：给药方案设计的关键输入

在抗流感这条赛道上，耐药屏障的分量比其他抗感染领域都重。原因藏在病毒的"手艺"里——流感的RNA聚合酶没有校读功能，复制起来错漏百出，突变率高达每位点每轮10⁻⁴到10⁻⁵。换句话说，给它几轮复制的工夫，耐药突变就能被筛出来。这就逼着研发团队把耐药屏障的功课提到体外阶段做完，绝不能拖到IND临门一脚才发现问题。

NA抑制剂 vs. PA内切酶抑制剂耐药特征对比

NA抑制剂类（奥司他韦）：H275Y是H1N1最主要耐药突变，E119V/D在H3N2中可出现；H275Y突变对复制适应性代价较低（能高效传播），是该类药物临床应用的主要风险点。

PA内切酶抑制剂类（玛巴洛沙韦）：I38T是主要耐药突变，免疫抑制患者和儿童中耐药率相对较高；I38T突变株的适应性代价也较低，须重视。

新型候选物的耐药谱完全阐明，是获得监管机构认可的重要加分项，建议在IND申报前尽可能完成完整的耐药机制表征。

参考：Hussain M, et al. Drug resistance in influenza A virus: the epidemiology and management. Infection and Drug Resistance. 2017;10:121–134.

02

体内药效评价：把体外数据转化为

临床依据

2.1 小鼠致死性肺部感染模型：体内药效的基础门槛

说到体内药效，小鼠致死性感染模型是绕不开的**关。它最基础、用得也最多，看的就是7到14天的存活率和体重曲线。这块数据是IND包的压舱石，FDA和CDE的指导原则里，它也是**被点名要的非临床有效性证据。

▲ 实验用 BALB/c 小鼠（SPF 级）

建模 01 毒株选择与小鼠品系 常用鼠适应株：A/PR/8/34（H1N1，PR8，经典标准株，致死剂量可**调控）用于一般药效评价；近年来也可选择经鼠适应的H3N2株或H1N1pdm09鼠适应株以提升临床相关性。小鼠品系：DBA/2J对流感病毒最敏感（半数致死剂量**），BALB/c和C57BL/6也广泛使用。6—8周龄雌性小鼠为标准，体重须均一（组间差异 < 2 g）。

建模 02 接种方式与感染剂量 接种方式：轻度麻醉后（异氟烷吸入）经鼻腔滴入（Intranasal，i.n.），每鼻孔滴入病毒液25—30 µL（总量50 µL），操作

中保持小鼠竖直体位30—60秒使病毒充分进入下呼吸道。感染剂量：通常为5—10倍LD₅₀（半数致死剂量），须在正式实验前完成LD₅₀预实验验证（Reed-Muench法计算）。

建模 03 给药方案与评价时间点 给药时机：治疗给药通常在感染后1—4 h开始（模拟临床早期治疗），也可设计感染后24 h或48 h给药组（模拟延迟治疗，评价治疗窗口期）。给药疗程：通常5天（参照奥司他韦临床给药疗程）。对照组必须包含：溶媒对照（感染）、阳性对照药（奥司他韦，建议采用人体治疗剂量对应的鼠等效剂量）、可设空白对照（未感染给溶媒）。每组通常n = 8-10。

终点 04 主要终点与次要终点 主要终点（存活率模型）：每日记录体重和临床评分（竖毛、驼背、活动减少各1分，共3分），体重下降 > 25%视为人道终点。观察14天，绘制Kaplan-Meier存活率曲线。次要终点（病毒载量模型，非致死感染）：感染后第3天或第5天（病毒复制高峰）处死部分小鼠，取肺组织匀浆测定病毒滴度（TCID₅₀或PFU），同步进行肺部病理组织学评分（炎症浸润、肺泡损伤）。两类终点须分组设计（存活组和取样组分开设计），不可在同一批小鼠上混用。

昌柏科技拥有成熟的小鼠流感感染模型平台，下图为 BALB/c × PR8 模型的实测建模数据：

▲ 昌柏科技实测：BALB/c 小鼠经鼻 PR8 攻毒模型（左：空白组 vs 模型组体征与肺组织；右：肺组织病毒载量动态曲线）

2.2 小鼠非致死性感染模型：病毒载量定量与给药时机评价

换到非致死模型（亚致死剂量感染），核心终点就从"活没活下来"变成了"肺里还剩多少病毒"。它的好处很实在：小鼠能撑到实验终点（第3天或第5天），肺组织病毒载量量得清清楚楚，剂量-效应关系于是立得住。更妙的是，治疗给药和预防给药两种时机的清除效果，能在同一套体系里直接掰开来比。

建模 01 感染剂量与终点设计 使用低于LD₅₀接种，确保小鼠在体重下降到底后可自然恢复（模型验证：溶媒对照组存活率须 > 70%）。主要终点：感染后第3天和第5天各处死一批小鼠，取双肺完整组织匀浆后梯度稀释，TCID₅₀法或PFU法定量病毒滴度，以log₁₀ TCID₅₀/g肺组织为主要疗效指标。

建模 02 给药方案：治疗性与预防性给药对比 非致死模型有个独到之处：两种给药策略能在同一个实验里并排着看，候选物的临床潜力也就摸得更全。先说治疗性给药——感染后1到4小时（早治疗）或者拖到24、48小时（晚治疗）才开始下药，对应的是病人确诊后才吃药的真实场景，看的是不同窗口期里病毒清得干不干净。再说预防性给药，把药提前到攻毒前24小时、2小时给下去，考的是暴露前预防（PrEP）这一手。别小看这条路：大流行里的密接者、本就脆弱的高危人群，往往就指着它。而且奥司他韦、玛巴洛沙韦在这个方向上都已经拿到了适应症，新药想做出差异，这里是个值得切入的口子。剂量上建议铺3到4个梯度，从低到高把剂量-效应关系拉起来；治疗组、预防组也都得各自配齐溶媒对照和奥司他韦阳性对照，少一个都不踏实。

昌柏科技可在非致死模型中输出完整的剂量-效应数据。

昌柏科技实测：巴洛沙韦 BALB/c 肺部清除模型，低/中/高剂量组肺组织病毒载量呈显著剂量-效应关系（QPCR 与 TCID₅₀ 双终点，****P<0.0001）

2.3 雪貂感染模型：临床相关性**的金标准

要找一个跟人感染过程最像的动物模型，雪貂大概是当下**的答案——FDA CDER和WHO都把它当作抗流感药效的重要支撑模型。秘密在于雪貂的上呼吸道：它的受体分布（α-2,6唾液酸连接）跟人高度相似，意味着不必费劲去做动物适应株，临床分离株拿来就能直接建模，当下流行株什么脾性，它照单全收。

▲ 实验用雪貂（6–12 月龄，血清学阴性）

建模 01 动物选择与病毒接种 雪貂：6—12月龄成年雪貂（雌性或雄性），体重1.0—1.5 kg，使用前须通过HI试验确认对拟用毒株血清学阴性（排除既往感染免疫）。接种方式：轻度麻醉后鼻腔滴入临床分离株病毒液（通常10⁵—10⁶ TCID₅₀/500 µL），不需要鼠适应株即可高效感染，模拟临床感染路径。

建模 02 临床监测指标 雪貂感染模型特有的优势在于可同步监测多项接近人类临床症状的指标：体温（直肠温度，每日测定，感染后24—48 h通常出现发热）、体重变化（每日称重，重度感染组体重下降通常 > 10%）、临床评分（活动度、鼻分泌物量、喷嚏频率，各1—3分），以及鼻腔冲洗液（Nasal Wash）病毒滴度（感染后D1、D3、D5、D7采集，定量TCID₅₀）。

建模 03 给药方案与组织终点 给药时机：与小鼠模型类似，治疗组通常感染后1—4 h开始给药，疗程5天。必须设阳性对照（奥司他韦标准剂量，雪貂等效剂量，10 mg/kg BID）。组织终点：感染后第3天或第5天处死部分动物，收集鼻甲、气管、肺组织进行病毒载量定量（TCID₅₀或RT-qPCR）及组织病理学评价（炎症评分，肺泡损伤程度）。鼻腔冲洗液病毒滴度是雪貂模型最核心的纵向药效指标——峰值病毒滴度的降低程度（log₁₀减少量）是与临床症状评分相关性**的终点。

雪貂模型：何时做、为什么做

雪貂模型通常不是IND数据包的强制要求，但在以下情况下强烈推荐：①候选物作用于人鼻咽上皮（吸入制剂、滴鼻给药）；②候选物声称覆盖奥司他韦耐药株（须在非鼠适应耐药株上验证）；③候选物拟申报大流行流感亚型（H5N1等），FDA CBER明确要求非鼠适应株动物模型数据；④候选物与现有药物相比的差异化定位需要更高临床相关性证据支撑。

参考：Belser JA, et al. Ferret models of influenza virus infection. Veterinary Pathology. 2020;57(5):671–677.

昌柏科技具备雪貂感染模型的完整操作能力

昌柏科技实测：雪貂 H1N1 攻毒模型，含体重变化、肺/鼻洗液病毒载量、肺组织 HE 染色与免疫组化全套终点

03

三类模型的综合比较与选择逻辑

三个模型各有长短，没有谁能通吃。实际项目里，到底用哪个、要不要几个搭着上，得看候选物打什么适应症、走什么给药途径、研究想拿到什么。下面这张表，把三者放在一起对照着看，选起来心里就有数了。

昌柏科技抗流感药物药效评价服务能力

平台硬实力：自主分离临床流感菌毒株 2000+ 株（3年内、多地域、来源可溯源）；病毒培养滴度可达 1×10⁸ PFU/mL；空斑法 / qPCR / TCID₅₀ / 微量中和多法并行；通过 CNAS 认可的 A/BSL-3 与 A/BSL-2 生物安全实验室，可开展 H5N1 等高致病性毒株评价。本系列前述各环节实验均可在昌柏科技一站式完成——

【体外药效】 EC₅₀/CC₅₀/SI全套（CPE抑制法 + 酶活抑制检测）；多亚型毒株覆盖（H1N1/H3N2/B型）；已知耐药突变株（NA-H275Y、PA-I38T等）；NA酶活抑制（IC₅₀）；作用时相分析（Time-of-Addition）；连续传代耐药筛选（10—15轮）

【小鼠致死性模型】 PR8（H1N1）鼠适应株，经鼻感染；14天存活率 + 体重 + 临床评分；溶媒对照 + 奥司他韦阳性对照标准配置

【小鼠非致死性模型】 亚致死剂量感染；Day 3/Day 5肺组织病毒载量（TCID₅₀/QPCR）；多剂量梯度剂量-效应关系；治疗性与预防性给药方案对比

【雪貂感染模型】 临床分离株直接建模（含H275Y耐药株）；鼻腔冲洗液病毒滴度纵向追踪（D1—D7）；体温/体重/临床评分每日监测；肺/气管/鼻甲组织病毒载量 + 病理评分

下一期预告：临床研究篇——I期、II期、III期临床试验设计逻辑与流感抗病毒药物注册策略全拆解。

参考文献

[1] FDA Guidance for Industry: Influenza: Developing Drugs for Treatment and/or Prophylaxis. CDER. April 2011.

[2] De Clercq E, Li G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clinical Microbiology Reviews. 2016;29(3):695–747.

[3] Hussain M, et al. Drug resistance in influenza A virus: the epidemiology and management. Infection and Drug Resistance. 2017;10:121–134.

[4] Belser JA, et al. Ferret models of influenza virus infection. Veterinary Pathology. 2020;57(5):671–677.

[5] Hayden FG, Shindo N. Influenza virus polymerase inhibitors in clinical development. Current Opinion in Infectious Diseases. 2019;32(2):176–186.

[6] Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 1938;27(3):493–497.（MLD₅₀计算的经典方法来源）

[7] Smee DF. Progress in the discovery of compounds inhibiting orthomyxoviruses in animal models. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 2008;19(1):1–14.（小鼠和雪貂流感模型综述）

[8] CDE.《抗流感病毒药物临床研究技术指导原则》. 国家药品监督管理局药品审评中心.

[9] WHO GISRS. Antiviral Susceptibility Surveillance — Annual Summary Reports. WHO Global Influenza Programme.

本文系昌柏科技「流感管线全周期实战指南」系列第三期，所有监管信息以WHO、FDA及NMPA/CDE官方现行有效文件为准，建议读者在具体项目决策前查阅原始文件最新版本。