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上一期我们讨论了抗真菌新药“值不值得立项”：真正有机会的项目，不是泛化地追求“广谱”或一组漂亮的MIC，而是围绕耐药病原体、关键感染部位、给药便利性、安全性与药物相互作用，定义清晰的产品价值。立项完成后，研发团队随即面临更难的问题：如何从大量初步活性分子中，筛选并优化出一个能够覆盖目标病原体、经得住耐药挑战、在体内实现有效暴露，且具备IND可行性的候选化合物？

抗真菌发现的特殊难度在于：病原真菌与人体同为真核生物，选择性窗口先天更窄；侵袭性真菌病高度依赖免疫状态与感染部位；而许多难治感染又发生在合并复杂用药的重症或移植患者中。因此，研发攻坚不能被理解成“多做几个MIC、多跑几批动物”。它是一套从候选物发现到PCC（候选化合物确认）的连续决策体系。

本文核心问题

什么样的实验链条，才能把“体外有活性”的Hit，推进为一个具有明确靶点/机制、耐药风险可控、暴露可实现、模型可验证并可进入IND准备的候选化合物？

01

候选物发现：

三条路线，各有适用边界

抗真菌候选物发现通常并行采用表型筛选、靶点导向设计以及天然产物/老药再定位三类策略。它们不是互相替代的“技术偏好”，而是对不同生物学不确定性的回应。正确的选择取决于项目是否已有可信靶点、是否追求新机制、是否需要快速获得化学起点，以及后续能否承担机制去卷积与成药性优化工作。

1.1 表型筛选：最快发现活性，但不能停在“抑制生长”

表型筛选对抗真菌项目尤其有价值，因为它无需预先假设靶点，并能自动纳入候选物进入真菌细胞、抵抗外排和在真实细胞生理状态下保持活性的能力。标准化药敏方法通常采用CLSI或EUCAST肉汤微量稀释框架；酵母与丝状真菌在接种量、培养时间及终点定义上不同，曲霉等丝状真菌对棘白菌素的效应常以MEC而不是传统MIC呈现[1]。

•主筛：以主目标病原体的代表性标准株或参考株建立单点抑制筛选，并设置已知阳性药、溶媒、无细胞和无药生长对照。

•复筛：采用8—12点浓度梯度确认MIC/MEC或IC50，并同步复核化合物溶解度、沉淀、颜色/荧光干扰和批次一致性。

•反筛：至少并行评估哺乳动物细胞毒性；根据化学类型增加溶血、线粒体功能、非特异性膜损伤或聚集体干扰排查。

•去卷积：借助耐药突变谱、化学生物学探针、转录组/蛋白组、CRISPR/基因操作或靶蛋白结合实验，逐步缩小机制范围。

表型筛选的正确交付物

不是“某化合物对一株白念珠菌MIC为X”，而是：该化合物在哪些目标菌种中保持可重复活性；活性是否独立于非特异性细胞毒性；是否具备可优化的化学空间；以及下一步要用什么实验确认其机制与耐药风险。

1.2 靶点导向设计：机制清楚，更要证明“真菌细胞里真的有效”

靶点导向策略适用于已知关键酶、细胞壁合成通路或具有明确结构生物学基础的项目。当前抗真菌创新项目已验证或积极探索的机制包括β-1,3-葡聚糖合成相关通路、GPI锚定蛋白生物合成相关的Gwt1、二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）及其他真菌特异或选择性可利用的生物合成节点。新机制项目的优势是可以从一开始就围绕选择性和耐药突变进行设计；风险是酶学纳摩尔活性不等于细胞内有效，更不等于感染部位有效。

•先证明靶点在目标种属和感染相关形态中具有必要性或高度相关性。

•用直接结合、酶活抑制与细胞层面的靶点参与度证据建立“化合物—靶点—表型”闭环。

•尽早比较人源同源蛋白/通路的选择性，避免把安全性风险拖至后期。

•用耐药突变定位、回补或等基因验证，确认药物压力下的关键突变确实能够解释药效下降。

1.3 天然产物和老药再定位：可以是优质Hit来源，但不是开发捷径

天然产物可提供传统合成库中较少见的三维骨架和复杂药效团；老药再定位则可能缩短早期安全性认知的建立时间。但两者的共同误区是把“已有活性”误认为“已有产品”。天然产物项目需要尽早解决来源稳定性、全合成/半合成路线、批间一致性、结构可修饰空间与暴露问题；老药再定位则必须证明给药剂量下能达到目标感染部位的有效暴露，并拥有新的临床定位或联合价值。

02

先导优化：

抗真菌候选物必须跨越的五道关

进入Lead优化后，项目的目标应从“提高单株活性”转为“降低未来失败概率”。以下五道关相互依赖：病原谱决定临床定位；耐药谱决定差异化；选择性决定安全窗；动态药效决定体外解释力；DMPK决定这些优势能否在体内实现。

2.1 病原谱关：从标准株走向临床场景

项目不应先追求覆盖尽可能多的菌种，而应围绕主适应症设计菌株面板。念珠菌项目通常需覆盖白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和耳念珠菌等与产品定位相关的种属；曲霉项目应包含烟曲霉及拟覆盖的其他曲霉或罕见霉菌。每一种新增病原体都意味着额外的暴露、模型、临床入组与标签论证负担。

耳念珠菌评价尤其需要克制。CDC明确指出，目前尚无耳念珠菌特异性的、正式建立的药敏临床折点；现有部分阈值基于近缘念珠菌、MIC分布和专家意见，且与临床结局的关联尚未确立[2]。对项目而言，更严谨的结论应是“对特定来源和耐药背景临床分离株保持体外活性”，而不是直接外推为临床疗效。

2.2 耐药覆盖关：差异化定位的生死线

耐药覆盖不能以“对照药MIC高、候选物MIC低”一句话概括。研发团队至少需要回答：对照药为何失效？候选物为什么仍然有效？候选物是否会与现有类别交叉耐药？该耐药机制在目标患者群中是否具有临床相关性？

抗真菌PK/PD研究中，fks和cyp51A是最常被用于研究耐药相关暴露—效应关系的基因；但外排和生物膜同样可能具有临床意义[3]。因此，耐药评价应从单基因“点检”升级为表型、基因型、动态药效和体内暴露的综合判断。

2.3 选择性关：真菌和人同为真核，安全窗必须早建

抗菌药物常可利用原核—真核差异获得较大选择性；抗真菌项目没有这样的天然优势。若候选靶点与人源蛋白高度同源，或化合物的主要效应来自非特异性膜损伤，体外抑菌越强并不意味着开发价值越高。

•建立多种哺乳动物细胞的细胞毒性反筛，不以单一肿瘤细胞系代表全身安全性。

•对可能影响膜、线粒体或氧化应激的化学类型，尽早增加对应机制风险筛查。

•将溶血、血浆蛋白结合、肝微粒体稳定性、CYP抑制/诱导和转运体风险前置。

•对口服长期治疗或与免疫抑制剂合用的定位，早期评估DDI比“后期补一个体外CYP包”更有决策价值。

2.4 动态药效关：MIC之外，还要看杀菌、耐受和生物膜

MIC/MEC是标准化起点，但只是特定时间点、特定培养条件下的相对效力。Time-kill可揭示不同浓度和时间下真菌负荷变化，用于比较候选物的杀菌/抑菌速度、后抗真菌效应和联用效应。对于曲霉等丝状真菌，CFU并不总能准确反映组织或菌丝负荷；体外与后续模型中需结合形态学、分子定量或生物标志物解释[3]。

此外，trailing和反常生长可能让单一MIC读数产生误导。肉汤微量稀释的终点会受接种量、培养时间、培养基和读数规则影响；CLSI与EUCAST在这些参数上存在差异，标准化和质量控制是可比性的前提[1]。如果项目主张优于同类药，应在同一方法、同一菌株批次和同一对照体系下比较，而非跨文献横向排列MIC。

2.5 成药性与暴露关：体外活性必须“买得起”人体暴露

任何候选物都应尽早接受一个现实检验：预计人体可实现的游离浓度，能否覆盖主目标菌种及关键耐药亚群？这要求DMPK不再是候选物确认后的附属工作，而应在Lead优化期与药效数据同步迭代。

抗真菌药物常用的PK/PD指数包括fAUC/MIC、fCmax/MIC和%fT>MIC；究竟哪一个与疗效关系最紧密，需要通过剂量分割、多个暴露水平和感染模型的暴露—反应分析确认，不能只凭药物类别照搬[3]。蛋白结合、活性代谢物和感染部位组织分布均可能改变解释。

研发攻坚的关键转折点

从“MIC降低一倍”转向“在计划给药方式下，能否在目标感染部位以可接受安全性达到覆盖关键菌株的游离暴露”。前者是化学优化指标；后者才是候选药物指标。

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机制与耐药屏障：

提前找到候选物的“软肋”

3.1 作用机制：建立化合物—靶点—表型闭环

对于新机制项目，建议按“直接结合/功能抑制—细胞内靶点参与度—耐药突变—遗传学或化学生物学验证”的层级推进。单独的分子对接、单次SPR信号或转录组变化均不足以证明靶点。更有说服力的证据是：药物压力下可重复出现的突变落在靶点或相关通路中，且经回补、等基因株或功能操作后能够重现药敏变化。

3.2 连续传代耐药：不是证明“不耐药”，而是量化风险

连续传代耐药实验的目标不应是得出“10代未耐药”的宣传结论，而是识别候选物在持续药物压力下的MIC/MEC变化轨迹、主要突变路径、突变稳定性、与标准治疗的交叉耐药，以及无药压力下的适应性代价。建议在多个临床相关菌株背景中平行开展，在关键节点保存克隆并进行复测和测序。

•每轮记录药物压力、MIC/MEC、菌落/菌丝表型和生长速度，避免只保留终点样本。

•对出现药敏上移的克隆，先做种属确认、MIC复测和污染排除，再开展全基因组或靶向测序。

•对候选突变进行因果验证，区分真正耐药驱动突变与背景漂移/补偿性改变。

•在无药环境和竞争培养中评价适应性代价；耐药突变的“能否传播和持续”与其临床威胁同样重要。

3.3 联合策略：为了临床问题，而不是为了做出“协同图”

联合用药可用于扩大耐药覆盖、降低毒性药物用量、增强难治感染疗效或降低耐药选择压力。棋盘格、time-kill和动态PK/PD模型均可提供不同层级的联用信息，但体外协同不等于临床获益。只有当两种药物可在感染部位同时达到相应暴露、毒性可接受、并且联合策略与真实治疗路径匹配时，协同才具备产品意义。

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从体外到体内：

模型选择必须服从临床定位

在研发攻坚阶段，体内模型的功能是淘汰无法转化的分子、建立暴露—反应关系并为人体剂量提供依据，而不是单纯“证明动物有效”。多数侵袭性真菌病发生在免疫功能受损患者，因此动物模型常需采用环磷酰胺、糖皮质激素等方式建立相应免疫抑制背景；不同病原体、感染部位和宿主状态不能共用同一套模型逻辑[3]。

对肺部霉菌感染，CFU未必与组织内真实菌丝负荷完全一致；半乳甘露聚糖、1,3-β-D-葡聚糖、qPCR、病理学及生存等多维终点组合，通常比单一CFU更能解释药效。对罕见侵袭性真菌病，预测性动物模型和PK/PD支持性证据可能直接影响后续临床开发可行性，因为传统随机对照试验常因入组困难而不可行[4]。

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候选化合物确认：

PCC不是“选出最强分子”，

而是选择风险最可控的分子

候选化合物确认应是一个跨药效、DMPK、早期安全性、制剂与临床策略的综合决策。以下表格是可按项目TPP调整的内部Go/No-Go框架；它不是监管规定的统一门槛，也不应把所有项目压入同一数值标准。

PCC决策的正确问题

不要问“哪一个分子的MIC**？”而要问：“哪一个分子在主目标患者中最有可能以可接受的给药方式，达到覆盖关键病原体和耐药亚群的感染部位暴露，并具有可被临床验证的优势？”

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【昌柏科技】抗真菌研发攻坚支持

•候选物发现与筛选：基于酵母/丝状真菌的表型筛选、复筛、哺乳动物细胞反筛和活性确认。

•菌株库与耐药评价：标准株、临床分离株、耐药株和质控株管理；MIC/MEC、动态杀菌、生物膜、联合药敏和耐药诱导。

•机制研究支持：靶点结合/功能验证、耐药突变测序及验证、交叉耐药与适应性代价评价。

•DMPK与PK/PD衔接：系统与组织暴露、游离浓度、剂量分割、暴露—反应建模及人体剂量预测支持。

•感染模型与候选物决策：围绕念珠菌、曲霉、隐球菌及罕见霉菌的匹配模型设计，整合药效、病理、真菌负荷和生物标志物。

结语

抗真菌研发攻坚的核心，不是把Hit推得更快，而是更早识别它是否经得住真实世界的四重考验：病原体多样性、耐药进化、感染部位暴露和宿主复杂性。能够通过这些考验的分子，才值得进入更昂贵、更长期的IND开发阶段。下一期将聚焦“体内药效与PK/PD转化”：不同感染模型如何选择、终点如何设计，以及如何让动物结果真正指导人体剂量和临床适应症。

参考文献与数据来源

[1] Berkow EL, Lockhart SR, Ostrosky-Zeichner L. Antifungal Susceptibility Testing: Current Approaches. Clin Microbiol Rev. 2020;33(3):e00069-19. doi:10.1128/CMR.00069-19.

[2] U.S. Centers for Disease Control and Prevention. Antifungal Susceptibility Testing for Candida auris. Updated 2024.

[3] Howard A, Hope W. Assessment of Antifungal Pharmacodynamics. J Fungi (Basel). 2023;9(2):192. doi:10.3390/jof9020192.

[4] Walsh TJ, et al. Meeting the Therapeutic Challenges of Emergent and Rare Invasive Fungal Diseases Through Novel Clinical Trial Designs. Open Forum Infect Dis. 2024;11(6):ofae257. doi:10.1093/ofid/ofae257.

[5] Pecho T, Zeitlinger M. Preclinical Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Studies and Clinical Trials in the Drug Development Process of EMA-Approved Antifungal Agents: A Review. Clin Pharmacokinet. 2024;63:13-26. doi:10.1007/s40262-023-01327-2.

[6] World Health Organization. Antifungal agents in clinical and preclinical development: overview and analysis. 2025.

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