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先看核心问题：

候选分子凭什么进入下一阶段？

HIV小分子药物研发早期，酶活实验中表现最强的分子，未必适合继续开发。后续评价还要看细胞通透性、临床相关病毒活性、安全窗口、耐药谱、联合用药适配性和人体暴露可行性。

候选物发现阶段需要建立一条连续的证据链：从靶点和作用机制出发，逐步验证细胞活性、病毒谱、耐药风险、PK/PD和成药性。靶点越新，越需要通过多层实验判断其药物开发潜力。

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围绕HIV生命周期寻找干预机会

HIV感染过程包括病毒进入、逆转录、核转运、整合、转录、蛋白加工、装配、成熟和释放。不同阶段对应不同的药物设计思路。

1.1病毒进入和融合

病毒包膜蛋白与宿主CD4受体及共受体相互作用，完成细胞进入。进入和融合抑制剂可能通过阻断病毒与宿主细胞结合、抑制构象变化或干扰膜融合发挥作用。

这一方向需要关注包膜变异、病毒嗜性和细胞模型差异。受体表达不同，同一候选物在不同细胞系统中可能出现不同结果。因此，早期筛选应根据项目目的设置相应的细胞模型，避免单一体系带来的误判。

1.2逆转录

HIV逆转录酶将病毒RNA转化为DNA。核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂作用机制不同，所涉及的耐药突变、细胞内活化、代谢物和长期安全性风险也不完全相同。

如果候选物属于前药，或需要细胞内活化，就需要把细胞内代谢和活性代谢物纳入早期评价。**生化酶活结果，无法说明药物在感染细胞内一定能够发挥作用。

1.3整合

病毒DNA整合到宿主基因组，是建立持续感染的重要步骤。整合酶抑制剂已经成为现代ART的重要组成部分。候选物研究应同时关注野生型病毒、既往整合酶抑制剂治疗失败后的突变组合，以及不同病毒亚型或临床背景带来的敏感性差异。

1.4蛋白酶、装配和成熟

病毒多聚蛋白需要正确切割和成熟，才能形成具有感染性的病毒颗粒。蛋白酶抑制剂和衣壳相关抑制剂可能影响这一过程。

对于新机制药物，除检测病毒载量外，还可以结合病毒颗粒成熟度、感染性、复制动力学或形态学观察进行机制解释。每项检测都应对应一个明确的研究问题，避免简单堆叠实验项目。

1.5潜伏感染和病毒储存库

潜伏感染细胞通常不产生大量病毒，传统抗病毒药物难以直接清除。储存库相关药物可能需要与免疫治疗、潜伏逆转或病毒转录调节策略联合开发。

此类项目的早期终点需要根据机制和开发目的单独设计。研究团队应提前区分机制指标、储存库指标和临床可转化指标，并为后续研究做好方法学准备。

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靶点验证需要三层证据

2.1**层：

病毒遗传学证据

可通过定点突变、反向遗传学、病毒适应性研究和保守性分析，判断某个靶点或关键位点对病毒复制的重要性。

“对病毒重要”仍不足以支持药物开发。还需要评估位点的结构可及性、结合空间和保守性。如果位点容易发生自然变异，或突变后病毒仍能保持较好的复制能力，后续耐药风险可能增加。

2.2第二层：

药物与靶点的直接关系

酶活抑制结果不能单独证明药物直接作用于靶点。根据项目特点，可以结合热稳定性偏移、表面等离子共振、等温滴定量热、竞争结合、结构生物学或其他正交方法进行验证。

早期还要注意非特异性聚集、荧光干扰、氧化还原干扰和高浓度假阳性。候选物如果只在单一检测平台中产生信号，应先完成确认实验，再进入后续筛选。

2.3第三层：

细胞和病毒水平的一致性

候选物的酶活、细胞活性、作用时相、耐药突变和结构变化应尽量相互支持。

只有酶活而没有细胞活性，可能提示细胞通透性不足、细胞内暴露不足或代谢失活。只有细胞活性而缺少靶点证据，则需要排除非特异性细胞效应。将不同结果放入同一张机制图中，更有助于判断候选物的真实价值。

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候选物发现的常见路线

3.1结构导向药物设计

利用靶蛋白结构、结合口袋和已知配体开展分子对接、药效团设计和构效关系优化。计算结果有助于缩小实验范围，但不能代替湿实验验证。

3.2基于已知配体的筛选

根据已上市药物或已知活性分子的结构特征，寻找新骨架、低交叉耐药分子或更适合长效制剂的结构。

3.3生化和细胞双筛选

先用酶活或结合实验筛选靶点活性，再用细胞模型确认候选物能否进入细胞并抑制病毒复制。这种组合有助于减少只在生化体系中有效的分子进入后续阶段。

3.4表型筛选

通过细胞表型发现抗病毒分子，再结合耐药突变、组学、靶点结合和化学探针反推作用机制。表型筛选获得的命中物，需要进一步开展机制去卷积和非特异性效应排查。

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候选物优化需要同步考虑成药性

先导化合物优化可同步关注：

•水溶性和化学稳定性；

•细胞通透性和细胞内蓄积；

•血浆蛋白结合；

•人和动物肝微粒体稳定性；

•活性代谢物；

•口服吸收和首过效应；

•半衰期和清除；

•CYP和转运体相互作用；

•hERG、遗传毒性和线粒体风险；

•合成路线和克级放大可行性；

•口服、长效或其他制剂路线。

如果候选物需要很高的临床暴露才能覆盖体外活性，或者必须依赖增强剂才能达到目标浓度，项目团队应在早期开展临床药理和药物相互作用评价，并明确这种开发策略对给药方案和后续临床研究的影响。[1]

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耐药风险要前置到候选物发现阶段

HIV药物耐药风险与靶点保守性、病毒复制速度、药物压力、单个位点突变效应和联合治疗背景有关。早期研究可以从以下方面展开：

•分析靶点自然变异；

•评价临床耐药突变对候选物活性的影响；

•开展连续传代耐药筛选；

•通过反向遗传学验证候选突变；

•评价耐药突变的复制适应性；

•比较候选物与现有药物的交叉耐药。

耐药屏障需要结合药物浓度、病毒学抑制程度、联合用药和临床暴露综合判断，不能脱离研究背景给出单一结论。2025年IAS-USA耐药突变更新可作为现有药物耐药突变解释和评价面板设计的参考。[2]

Stanford HIV Drug Resistance Database可以辅助解释基因型耐药结果，但数据库注释不能替代项目自身的表型验证和临床判断。[3]

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候选物锁定前需要回答的问题

•对目标病毒和临床分离株是否保持活性？

•对既往治疗相关耐药突变是否有活性？

•是否与现有核心药物存在明显交叉耐药？

•是否具备可实现的人体暴露？

•是否适合联合用药？

•是否具有清晰的临床差异化？

•是否具备稳定、可放大的制备和制剂路线？

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候选物发现阶段常见误区

7.1只追求最强酶活

酶活强不代表细胞内有效。细胞通透性、蛋白结合和代谢稳定性同样重要。

7.2只使用单一实验室毒株

标准株适合质控，但不能代表不同亚型、临床分离株和耐药病毒。病毒面板应与产品定位相匹配。

7.3把计算机预测当作机制证明

对接和药效团只能提出假设，需要通过正交结合、细胞活性和耐药突变验证。

7.3候选物锁定后才考虑制剂

如果候选物溶解度、稳定性、晶型或长效制剂可行性过差，项目可能在后期被迫更换分子。

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昌柏科技可提供的支持

昌柏科技可协助开展HIV小分子药物早期筛选、细胞抗病毒模型建立、作用机制研究、候选分子比较、耐药代表株评价以及候选物综合决策。对于已有明确靶点和先导分子的项目，可进一步协助建立病毒谱、耐药和联合用药评价体系，为项目从靶点假设走向研究候选物提供实验和数据支持。

参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Human Immunodeficiency Virus-1 Infection: Developing Antiretroviral Drugs for Treatment: Guidance for Industry. Center for Drug Evaluation and Research; 2015Nov2.Availablefrom: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Human-Immunodeficiency-Virus-1-Infection--Developing-Antiretroviral-Drugs-for-Treatment.pdf (accessed 18 September 2026).

[2] Wensing AMJ, Calvez V, Ceccherini-Silberstein F, Charpentier C, Günthard HF, Jacobsen DM, Paredes R, Shafer RW, Richman DD. 2025 update of the drug resistance mutations in HIV-1. Top Antivir Med. 2025;33(2):457–473. PMID: 40472382. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40472382/(accessed18 September 2026).

[3] Stanford University. Stanford HIV Drug Resistance Database. Available from: https://hivdb.stanford.edu/(accessed 18 September 2026).

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